尿道狹窄是泌尿外科常見難題，手術治療常需器官或組織移植，但面臨供體不足和排異風險。組織工程研究致力于體外培養組織以解決這一問題，其中生物材料和制造方法是關鍵。明膠甲基丙烯酰（GelMA）因良好的生物相容性等優勢在組織工程中備受關注，而體積生物打印（VBP）能快速制造厘米級構建體且維持高細胞活力。人尿源性干細胞（hUSCs）具有多種優勢，是尿道組織工程的理想種子細胞。然而，使用 GelMA - 3D 打印構建宏觀尿道組織面臨諸多挑戰，如維持細胞活力和功能、整合多種細胞類型等。此外，從二維培養到三維環境，確保細胞長期活力和功能是一大難題。低強度脈沖超聲（LIPUS）雖被認為可促進細胞增殖，但它對 3D 支架中 hUSCs 的影響尚不明確。
       來自廣州醫科大學第五附屬醫院的賴德輝教授、卞軍教授團隊合作利用 VBP 技術將 hUSCs 整合到 GelMA 支架中，研究不同參數的 LIPUS 對 hUSCs 活力的影響，并探索其分子機制。相關工作以 “Low - intensity pulsed ultrasound promotes cell viability of hUSCs in volumetric bioprinting scaffolds via PI3K/Akt and ERK1/2 pathways” 為題發表在《Biomedical Materials》上。
 

研究內容
1. hUSCs的分離鑒定與多向分化能力驗證
通過對健康男性尿液樣本進行離心、培養等處理獲取hUSCs，運用流式細胞術對其表面抗原進行鑒定，并使用特定誘導培養基進行成骨、成脂分化誘導，再通過茜素紅和油紅O染色來評估分化情況。結果顯示，hUSCs呈現梭形形態，高表達CD44、CD73和CD90等干細胞相關抗原，且能成功分化為成骨細胞和脂肪細胞，具備多向分化潛能。
 

2. GelMA生物支架的制備與特性研究
將GelMA粉末溶解在PBS中，添加交聯劑和hUSCs制備生物墨水，利用3D打印技術構建支架，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察其微觀結構，通過壓縮測試獲取應力 - 應變曲線以分析機械性能，進行體外降解實驗探究降解特性。結果表明，GelMA生物支架具有可打印性，呈現多孔結構，孔徑在80μm左右，其楊氏模量與濃度呈正相關，在PBS緩沖液中約21天可完全降解，展現出良好的生物相容性和可降解性。
 

3. LIPUS對2D環境中hUSCs增殖的影響
設置不同的LIPUS強度，對培養在平板上的hUSCs進行刺激，運用CCK - 8檢測和活/死染色技術，在不同時間點評估細胞增殖情況。結果表明，在一定范圍內，LIPUS能促進hUSCs增殖，其中100 mW/cm^2 強度且連續兩次10分鐘處理的效果最佳，該條件下hUSCs的細胞密度和增殖活性顯著高于對照組。
 

4. GelMA濃度對hUSCs在3D支架中生長的影響
制備不同濃度（2.5%、5%、7.5%、10%）的GelMA生物支架，將hUSCs接種其中，通過活/死染色在不同時間點觀察細胞生長情況。結果顯示，2.5% GelMA濃度的支架最有利于hUSCs的黏附和生長，隨著GelMA濃度增加，hUSC的黏附數量明顯減少，細胞生長狀態變差。
 

5. LIPUS對3D環境中hUSCs增殖的影響及機制探究
在3D GelMA支架培養體系下，改變LIPUS強度，利用CCK - 8檢測、活/死染色、流式細胞術以及Western blot分析等方法，檢測hUSCs的增殖、細胞周期分布以及相關蛋白表達水平。結果表明，150 mW/cm^2 的LIPUS對3D支架中hUSCs的增殖刺激效果最佳；LIPUS可促使hUSCs從G0/G1期進入S和G2/M期，增加細胞周期相關蛋白表達，同時激活ERK1/2和PI3K - Akt信號通路，而抑制這兩條通路會減弱LIPUS誘導的hUSC增殖作用。
 

研究結論
      本研究表明，低強度脈沖超聲（LIPUS）可促進 3D GelMA 支架中人尿源性干細胞（hUSCs）的增殖，這可能是通過激活 ERK1/2 和 PI3K-Akt 信號通路實現的。實驗數據為在 3D 培養環境中利用 LIPUS 促進 hUSCs 增殖提供了支持。研究確定了適用于 hUSCs 的 LIPUS 最佳參數，即頻率 1.5MHz、空間平均時間平均強度（ISATA）為 150 mW/cm^2、每次照射 10 分鐘，連續照射兩次 。同時發現，2.5% 濃度的 GelMA 支架最有利于 hUSCs 的生長和增殖。這些結果為尿道組織工程中應用 LIPUS 和 GelMA 支架提供了理論依據和實踐指導。
挑戰與展望
     在材料方面，GelMA 支架需進一步優化，以更好地平衡物理可打印性與生物相容性，特別是在處理脆弱干細胞時，需在保證細胞活力的同時提升打印性能。在 LIPUS 應用上，雖然確定了促進 hUSCs 增殖的最佳參數，但不同細胞類型對 LIPUS 的反應存在差異，其作用機制尚未完全明確，仍需深入研究。未來，有望開發出更理想的生物材料，與 LIPUS 更有效地結合，構建出更接近人體生理環境的組織模型，推動組織工程和再生醫學的發展，為尿道狹窄等疾病的治療帶來新的突破。

文章來源：
https://doi.org/10.1088/1748-605X/ad920f

(責任編輯：admin)

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