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基于液滴3D低溫生物打印技術(shù)構(gòu)建自立式立體結(jié)構(gòu)

時(shí)間:2025-06-21 10:39 來源:南極熊 作者:admin 閱讀:

       在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,液滴生物打印技術(shù)因具有高分辨率、非接觸式操作等優(yōu)勢而備受關(guān)注,但其依賴低黏度生物墨水,導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)缺乏自支撐性,難以構(gòu)建復(fù)雜3D立體結(jié)構(gòu),且多材料圖案化需繁瑣的層間交聯(lián)步驟,限制了應(yīng)用場景。來自哈佛醫(yī)學(xué)院的Yu Shrike Zhang教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種液滴3D低溫生物打印技術(shù),通過將液滴打印與低溫打印結(jié)合,利用低溫板(-5至-15℃)使低黏度生物墨水(如7.5% GelMA)在沉積后立即凍結(jié),無需額外支撐即可形成自立式結(jié)構(gòu),同時(shí)避免多材料混合問題。該技術(shù)成功打印出金字塔、多層網(wǎng)格及字母“H”“V”等單材料或多材料復(fù)雜結(jié)構(gòu),并實(shí)現(xiàn)了C2C12肌成纖維細(xì)胞、NIH/3T3成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的封裝,細(xì)胞存活率在培養(yǎng)2-3周后達(dá)80%-90%,還構(gòu)建了血管化乳腺癌模型驗(yàn)證多細(xì)胞共培養(yǎng)潛力。相關(guān)工作以“Droplet 3D cryobioprinting for fabrication of free﹕tanding and volumetric structures”為題發(fā)表在《Aggregate》上。
 


研究內(nèi)容
1. 液滴低溫生物打印機(jī)示意圖及可實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)示例,通過自主搭建的雙微閥低溫打印系統(tǒng),結(jié)合壓力調(diào)控(100-300 mbar)與低溫板(-5至-15℃)凍結(jié)技術(shù),研究了低黏度生物墨水(7.5% GelMA)的3D打印能力。結(jié)果表明,系統(tǒng)可生成1-10 nL穩(wěn)定液滴,通過單/多材料噴射成功構(gòu)建金字塔、多層網(wǎng)格及字母“H”“V”等自立式結(jié)構(gòu),驗(yàn)證了低溫凍結(jié)對維持低黏度墨水空間形態(tài)的關(guān)鍵作用,避免傳統(tǒng)液滴打印的擴(kuò)散坍塌問題。   

 

圖1. 液滴低溫生物打印機(jī)示意圖及可實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)示例。   


2. 液滴尺寸與打印高寬比量化分析圖,利用光學(xué)成像系統(tǒng)(SmartDrop)和流變儀,研究了壓力、閥門開啟時(shí)間(500-700 µs)及打印頻率(0.1-20 Hz)對液滴體積和結(jié)構(gòu)高寬比的影響。結(jié)果顯示,低壓力(100 mbar)與短開啟時(shí)間(500 µs)產(chǎn)生最小液滴(0.8 nL),低溫板溫度越低(如-15℃)、頻率越低(如0.1 Hz),結(jié)構(gòu)高寬比越高(>4),且凍結(jié)后水凝膠儲(chǔ)存模量從室溫的0.01 Pa·s躍升至50 Pa·s以上,揭示了低溫通過增強(qiáng)材料彈性維持打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的機(jī)制。   
 

圖2. 液滴低溫生物打印的打印性能。   


3. 細(xì)胞封裝存活率與形態(tài)演變圖,通過活/死染色(Calcein-AM/PI)和免疫熒光染色(F-actin/DAPI),研究了C2C12肌細(xì)胞、NIH/3T3成纖維細(xì)胞在-5℃/-10℃打印后的存活與增殖行為。結(jié)果表明,初始存活率約50%,培養(yǎng)14天后升至80%-90%,細(xì)胞呈擴(kuò)散生長并形成互連網(wǎng)絡(luò);星形膠質(zhì)細(xì)胞在3%低濃度GelMA中鋪展面積更大(14天達(dá)初始3倍),但結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性隨濃度降低而下降,提示需平衡細(xì)胞活性與力學(xué)性能。   
 

圖3. 液滴低溫生物打印C2C12和NIH/3T3細(xì)胞。   


4. 不同GelMA濃度下星形膠質(zhì)細(xì)胞打印表征圖,通過對比3%與7.5% GelMA濃度,研究了水凝膠剛度對星形膠質(zhì)細(xì)胞行為的影響。結(jié)果顯示,3% GelMA組第7天存活率(80%)顯著高于7.5%組(60%),細(xì)胞覆蓋面積在14天達(dá)到7.5%組的2.3倍,但低濃度水凝膠在培養(yǎng)后期出現(xiàn)輕微結(jié)構(gòu)坍塌,表明軟基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞鋪展但需優(yōu)化長期穩(wěn)定性。   
 

圖4. 不同GelMA濃度的液滴低溫生物打印及細(xì)胞行為分析。   


5. 多材料空間異質(zhì)性結(jié)構(gòu)打印圖,利用雙微閥系統(tǒng)加載熒光染料標(biāo)記的GelMA,研究了多材料分層打印的可行性。結(jié)果表明,低溫凍結(jié)可防止不同材料混合,成功打印交替層狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu),界面清晰無擴(kuò)散;進(jìn)一步構(gòu)建MCF-7腫瘤細(xì)胞與HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,證明兩種細(xì)胞在21天內(nèi)保持空間分隔并正常增殖,驗(yàn)證了模擬復(fù)雜組織微環(huán)境的能力。   
 

圖5. 液滴低溫生物打印的多材料結(jié)構(gòu)。   


6. 血管化乳腺癌模型共培養(yǎng)表征圖,通過分層打印兩層MCF-7細(xì)胞(2.5×10⁶ cells/mL)與兩層GFP標(biāo)記HUVECs(5×10⁶ cells/mL),研究了多細(xì)胞類型的空間分布與相互作用。結(jié)果顯示,HUVECs在腫瘤細(xì)胞層上方形成血管樣結(jié)構(gòu),培養(yǎng)21天后交界處可見內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞方向萌芽,兩組細(xì)胞存活率分別達(dá)90%和80%,證實(shí)該技術(shù)在構(gòu)建血管化腫瘤模型中的應(yīng)用潛力。   
 

圖6. 液滴低溫生物打印構(gòu)建的血管化乳腺癌模型。


研究結(jié)論
     本研究開發(fā)了液滴3D低溫生物打印技術(shù),融合液滴打印與低溫凍結(jié),解決了傳統(tǒng)液滴打印難以構(gòu)建復(fù)雜3D自立結(jié)構(gòu)的難題。系統(tǒng)可生成1-10 nL液滴,通過-5至-15℃低溫板實(shí)現(xiàn)低黏度水凝膠(如7.5% GelMA)的快速固化,成功打印單/多材料立體結(jié)構(gòu)(如金字塔、血管化腫瘤模型),結(jié)構(gòu)高寬比最高達(dá)4以上。細(xì)胞封裝實(shí)驗(yàn)表明,C2C12、NIH/3T3等細(xì)胞在打印后培養(yǎng)14天存活率達(dá)80%-90%,星形膠質(zhì)細(xì)胞在3%低濃度水凝膠中鋪展更佳。多材料打印證實(shí)該技術(shù)可精準(zhǔn)控制細(xì)胞空間分布,構(gòu)建的血管化乳腺癌模型中腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞保持功能活性。本研究為復(fù)雜組織工程結(jié)構(gòu)和多細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建提供了新方法,但其在大尺寸結(jié)構(gòu)打印和細(xì)胞長期活性調(diào)控方面仍需優(yōu)化。

文章來源:

https://doi.org/10.1002/agt2.599


 

(責(zé)任編輯:admin)

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