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骨骼干細(xì)胞外泌體裝備3D打印仿生支架修復(fù)骨軟骨缺損

時間:2025-06-10 10:05 來源:EFL生物3D打印與生物制造 作者:admin 閱讀:

       骨軟骨缺損(OCDs)因軟骨無血管特性、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性及自我修復(fù)能力有限,成為臨床難題,傳統(tǒng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)療法受細(xì)胞異質(zhì)性和免疫原性限制,修復(fù)效果不足。來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的呂紅斌教授、曹勇副研究員利用單細(xì)胞RNA測序(ScRNA-seq)從人髕下脂肪墊(IFP)中鑒定出高軟骨分化潛能的骨骼干細(xì)胞(SSCs),提取其外泌體(SSC-Exos)并負(fù)載于3D打印仿生水凝膠支架。該支架通過釋放SSC-Exos中的miR-214-3p抑制JAG2信號通路,顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)軟骨分化,在大鼠OCD模型中實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨一體化再生。相關(guān)工作以“3D-printed advanced scaffold armed with exosomes derived from human skeletal stem cell identified by single-cell RNA sequencing enhances osteochondral regeneration”為題發(fā)表在《Bioactive Materials》上。
 

 


負(fù)載骨骼干細(xì)胞外泌體的仿生 3D 打印支架構(gòu)建及其用于骨軟骨再生的示意圖。

1. 單細(xì)胞RNA測序鑒定人髕下脂肪墊骨骼干細(xì)胞亞群,通過單細(xì)胞RNA測序(ScRNA-seq)和無監(jiān)督聚類分析,研究人髕下脂肪墊(IFP)及皮下脂肪組織(SAT)的細(xì)胞異質(zhì)性。結(jié)果顯示,IFP中存在高表達(dá)PDPN、CD73、CD164的骨骼干細(xì)胞(SSCs)亞群,其分化狀態(tài)更低(CytoTRACE評分更低),軟骨生成相關(guān)通路(如SOX9、COL2A1)活性顯著高于SAT來源細(xì)胞,且IFP-SSCs的軟骨分化潛能通過Alcian Blue染色和qPCR驗證優(yōu)于SAT細(xì)胞。      

 

 

圖1. 通過單細(xì)胞RNA測序鑒定骨骼干細(xì)胞亞群。



2. 骨骼干細(xì)胞外泌體(SSC-Exos)的分離與功能驗證,利用流式細(xì)胞術(shù)分選IFP-SSCs并提取外泌體,通過透射電鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析(NTA)和Western blotting表征其形態(tài)(杯狀,粒徑40–160 nm)及標(biāo)志物(CD81、TSG101、CD63陽性,Calnexin陰性)。功能實驗表明,SSC-Exos可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)高效攝取(PKH26標(biāo)記顯示紅色熒光聚集于胞質(zhì)),顯著上調(diào)軟骨分化標(biāo)志物SOX9、COL2、ACAN的mRNA和蛋白表達(dá),且其促分化效果優(yōu)于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(ADSC-Exos)。      
 

 

圖2. 骨骼干細(xì)胞外泌體的制備與表征。



3. 3D打印仿生水凝膠支架的制備與性能分析,采用紫外光固化3D打印技術(shù)構(gòu)建負(fù)載SSC-Exos的GelMA支架,通過掃描電鏡(SEM)觀察到支架具有多孔互連結(jié)構(gòu)(孔徑約100–200 μm),能量色散光譜(EDS)證實外泌體均勻分布于支架內(nèi)部。流變學(xué)測試顯示,支架儲存模量(G')在紫外固化后穩(wěn)定高于損耗模量(G''),具備剪切變稀特性;體外釋放實驗表明,SSC-Exos可持續(xù)釋放28天,累計釋放率約80%。      
 

 

圖 3. 骨骼干細(xì)胞外泌體的體外軟骨形成特性。



4. 支架在大鼠骨軟骨缺損模型中的修復(fù)效果,在大鼠股骨滑車缺損模型中植入SSC-Exos支架,通過大體觀察、micro-CT和組織學(xué)染色(H&E、Safranin O/Fast Green、Masson’s Trichrome)評估修復(fù)效果。結(jié)果顯示,術(shù)后8周時,SSC-Exos支架組缺損被新生透明軟骨樣組織完全填充,軟骨下骨骨體積/總體積(BV/TV)和骨小梁數(shù)量(Tb.N)顯著高于對照組(*P < 0.001*),且免疫組化顯示COL II和ACAN表達(dá)接近正常軟骨水平。      
 

 

圖4. 負(fù)載骨骼干細(xì)胞外泌體的3D打印仿生水凝膠支架的表征。   



5. miR-214-3p/JAG2信號軸調(diào)控機(jī)制研究,通過miRNA測序篩選出SSC-Exos中高表達(dá)的miR-214-3p,熒光素酶報告實驗證實其直接靶向JAG2 mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)。功能缺失實驗顯示,抑制miR-214-3p(miR-214-3pIN-Exos)可減弱SSC-Exos對BMSCs的促軟骨分化作用,而JAG2過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)該效應(yīng),提示miR-214-3p通過抑制Notch信號通路配體JAG2,促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。   
 

 

圖5. 外泌體的體內(nèi)釋放及修復(fù)后骨軟骨缺損的成像分析。



6. 組織修復(fù)的長期安全性與免疫原性評估,通過H&E染色觀察心、肝、脾、肺、腎等主要器官,結(jié)果顯示SSC-Exos支架組無明顯炎癥細(xì)胞浸潤或組織損傷,證實支架具有良好的生物相容性和低免疫原性。此外,長期跟蹤(8周)未觀察到腫瘤形成或異常組織增殖。      
 

 

圖6. 術(shù)后4周和8周時不同組修復(fù)組織的組織學(xué)評估。



研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種基于單細(xì)胞RNA測序篩選的人髕下脂肪墊骨骼干細(xì)胞外泌體(SSC-Exos)負(fù)載3D打印仿生水凝膠支架的骨軟骨再生策略。通過調(diào)控miR-214-3p/JAG2信號軸,SSC-Exos顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化,其搭載的3D支架通過多孔結(jié)構(gòu)實現(xiàn)外泌體持續(xù)釋放,在大鼠骨軟骨缺損模型中實現(xiàn)了關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨的一體化再生。組織學(xué)和影像學(xué)結(jié)果顯示,術(shù)后8周修復(fù)組織接近正常結(jié)構(gòu),軟骨特異性標(biāo)志物COL II和ACAN表達(dá)顯著上調(diào)。該系統(tǒng)結(jié)合外泌體的生物活性與3D打印的定制化優(yōu)勢,為骨軟骨缺損提供了無細(xì)胞、高安全性的修復(fù)方案,其多通道調(diào)控機(jī)制有望為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供新的思路。

文章來源:

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.04.028


 

(責(zé)任編輯:admin)

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