北京協和毛一雷教授團隊和馬文彬教授團隊發表: 3D生物打印矩陣
時間：2025-07-22 10:31 來源：南極熊 作者：admin 閱讀：次
3D3D18(E18)(GelMA)3D neuMatrix3D neuMatrixE18/(MCAO/R)大鼠模型的存活狀態、功能特征及轉錄組特性。這些發現證實了3D neuMatrix內多尺度神經回路的形成，展現了其在神經發育研究、疾病建模與藥物篩選及體外智能研究領域的寶貴潛力。
一、背景介紹：
大腦作為高度復雜的器官，其原代神經細胞模型對神經科學研究至關重要。傳統2D培養缺乏三維結構和細胞外基質(ECM)刺激，限制了神經網絡形成。而3D支架、類器官等模型雖部分解決該問題，但仍存在細胞活力低或結構調控不足等局限。3D生物打印技術憑借高通量、設計自由度高的優勢，成為構建功能性神經組織的新途徑。基于擠出的生物打印可精準控制細胞分布如皮層神經元分層、軸突方向性，但原代神經細胞對剪切力敏感，需優化打印參數與生物墨水。本研究選用生物相容性良好的明膠甲基丙烯酰(GelMA)，結合既往打印功能性肝組織的經驗，減少細胞損傷，促進突觸連接形成。
最終構建的3D neuMatrix是新型3D生物打印原代神經組織，具備復雜的局部與規模功能性神經網絡。通過單細胞測序和轉錄組分析證實，其在生理/病理狀態下均能高保真重現大腦皮層的細胞亞型與神經發育動態，為神經回路研究、疾病建模、藥物篩選及體外智能領域提供了創新平臺(圖1a)。
圖1. 3D neuMatrix的構建流程。
二、材料和方法
2.1 原代皮層神經元的3D生物打印
將混合后的生物墨水轉移至裝有21G針頭的滅菌注射器中，裝入3D生物打印機，并預設溫度。對噴嘴和成型室溫度進行微調，以確定在打印過程中保持最高細胞存活率的理想條件。生物打印過程使用基于擠出的生物打印機(SUNP BIOTECH公司的BioMaker 系列生物3D打印機)，遵循先前建立的方案。簡而言之，3D neuMatrix的整體形狀設計為立方體，框架間設有獨立通道，可最大化原代神經細胞與培養基的接觸面積。通過3D生物打印機在24孔板的各孔內以逐層擠出的方式連續制備 3D neuMatrix。打印速度設置為4.8 mm s-1，擠出速度設置為1.5 mm³ s-1。
隨后，3D neuMatrix經7.5 mW/cm-2的405 nm光照射10秒以促進交聯，之后加入1 mL完全培養基，在37°C、5% CO₂條件下培養。整個生物打印過程耗時約1小時。神經元成熟通過體外培養7天誘導，每2天更換一半培養基，隨后進行后續評估。
三、結果
3.1 3D neuMatrix 的關鍵生物學特性
將E18大鼠原代皮質細胞與GelMA、光引發劑按1.5×10⁷ cells/mL密度混合，采用21G 噴嘴(內徑510 μm)擠出打印，經405 nm光(7.5 mW/cm²)交聯10秒，構建7×7×1.5 mm 含500 μm互連通道的6層結構。優化后的參數減少了剪切力損傷，且可通過自修復水凝膠浴實現微型大腦等復雜結構的浮動打印(圖1b)。細胞活力在DIV 7達峰值(299±20%)，28天培養仍保持活性。HE染色和SEM顯示，細胞在多孔水凝膠中形成直徑超200 μm的簇，神經突相互連接，而2D培養細胞分布隨機(圖1c-g)。該模型通過生物墨水與打印工藝優化，實現了原代神經細胞的高活性三維封裝。
3.2 3D neuMatrix 中的多尺度神經網絡
體外培養期間，細胞簇體積顯著增長，前3天擴大3倍(8408 μm3增至30215 μm3)(圖2a,b)。Ki67陽性細胞數在DIV4達峰(42.8±5.6個/ROI)，DIV7降至25.5±4.3個/ROI，與體積增長和整體活力趨勢一致(圖2c)。細胞簇主要由成熟的NeuN陽性神經元組成，富含MAP2陽性突起和深染的SYN(表明豐富突觸)。Nestin陽性干細胞極少。盡管未主動篩選，GFAP陽性星形膠質細胞數量少于神經元，并在神經簇內形成沿神經突起延伸的支架樣結構(圖2d,e)。Imaris重建顯示，局部尺度上相鄰簇間存在復雜多分支神經突起網絡(圖2f)。毫米尺度上，整個3D neuMatrix形成了高度類似體內大腦樞紐和投射結構的三維神經網(圖2g)。
圖2. 3D neuMatrix中獨特的神經網絡結構。
3.3 3D neuMatrix 的功能連接與藥物響應性
利用Fluo-4 AM可視化鈣振蕩，評估3D neuMatrix的神經功能。微觀層面，簇內神經元獨立振蕩并間歇性協調放電。介觀尺度下，神經簇可分為5組，組內鈣放電高度同步，相距2 mm的簇組間也存在同步放電，證實其形成大規模功能性神經網絡(圖3a-e)。分析 DIV1-14的鈣信號發現，平均放電率、檢測到鈣放電的簇百分比隨培養時間上升，DIV 14略有下降，與細胞活力趨勢一致。全局平均相關性持續增加。綜合考慮，選擇DIV 7為后續研究時間點(圖3f - h)。通過神經遞質受體拮抗劑處理探究小分子影響，抑制GABA受體(BIC、PTX)顯著提升放電率，抑制谷氨酸受體(NBQX、AP5)則降低放電率；除AP5外，其余處理后全局平均相關性下降。該結果表明，興奮性與抑制性神經元共同參與網絡形成，二者平衡維持同步性，且3D neuMatrix對小分子的功能響應特性，使其適用于CNS疾病建模與藥物篩選(圖3i - l)。
圖3. 3D neuMatrix神經網絡的功能動態特性。
3.4 3D neuMatrix 中皮層轉錄組譜的重建
為驗證3D生物打印神經組織的轉錄保真度，對2D培養神經元、3D neuMatrix和E18大鼠皮層進行RNA-seq分析。PCA顯示3D neuMatrix與E18皮層的全局轉錄譜相關性顯著高于2D培養(圖4a,b)。通過差異基因(DEGs)分析，3D neuMatrix中E18皮層特征性上調/下調基因的富集分數分別為0.41和-0.39，顯著優于2D培養(圖4c-f)。GO和KEGG分析表明，3D neuMatrix激活細胞互作、ECM組織等通路，而2D培養富集鈣信號及神經退行性相關通路(圖4g-i)。GSVA進一步證實3D neuMatrix與E18皮層的通路富集模式更接近，尤其在神經元投射和突觸傳遞等特征上(圖4j)。對關鍵基因子集的分析顯示，3D neuMatrix在神經元突觸、ECM-受體互作等通路更貼近E18皮層，而大腦皮層特有的神經發育調控通路在體外模型中富集度較低。綜上，3D neuMatrix在分子層面高度重現體內神經組織特征，具備優異的生物學保真度。
圖4.基于RNA測序驗證3D neuMatrix的基因表達保真度。
3.5 3D neuMatrix 對大腦皮層細胞組成的重現
為探究3D neuMatrix的細胞組成及時序動態，在DIV 1和DIV 7開展snRNA-seq(圖 5a,b)，獲取36304個細胞并完成類型注釋(圖5a,c,d)。UMAP分析顯示神經亞群分布與體內皮層神經元分層一致，與大鼠皮層數據合并后分類穩定，細胞類型比例也與體內高度吻合，證實其精準重現大腦皮層細胞組成。
培養期間的細胞組成符合體內發育趨勢(圖5e)，尤其是神經膠質細胞。DIV7時神經前體細胞(NPC)從8.24 %降至1.61 %，星形膠質細胞(ASC)和少突膠質細胞(ODC)分別增至 13.86 %和3.98 %。興奮性神經元(EN)比例從46.64 %降至22.34 %，抑制性神經元(IN)穩定在22.9%左右，與鈣振蕩同步性增加一致。細胞周期分析表明DIV7時細胞分裂能力減弱。(圖5b,e,f)。
偽時間分析顯示，神經元呈現從未成熟神經元(IMN)到分化神經元的發育軌跡。IMN高表達放射狀膠質細胞標志物(Fabp7、Vim)，兼具泛神經元特征但缺乏成熟標志物，可能從分裂狀態轉變為休眠狀態；成熟神經元的神經投射和遞質分泌功能隨時間顯著增強，突觸組裝富集度維持較高水平(圖5g-j)。
圖5. DIV 1和DIV 7時3D neuMatrix的單細胞核RNA測序(snRNA-seq)分析。
3.6利用3D neuMatrix構建缺血性中風模型
為評估3D neuMatrix在疾病建模與藥物篩選中的潛力，以缺血性中風為模型，通過氧-葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)處理發現，OGD 4小時后細胞活力降至49.0±0.6%，鈣振蕩的放電速率和放電細胞百分比顯著降低，全局相關性呈上升趨勢(圖 6a-e)。轉錄組分析顯示，3D neuMatrix的OGD/R模型與大鼠MCAO/R模型的轉錄特征更吻合，其上調的缺氧響應、ECM相互作用等通路，較2D培養更準確模擬了缺血性中風的神經組織損傷機制(圖6f-m)。藥物篩選實驗中，依達拉奉和丁苯酞未能改善OGD/R后的細胞活力與功能，可能因4小時 OGD已造成不可逆損傷。綜上，3D neuMatrix在神經疾病建模和藥物研發中展現出獨特優勢，為體外研究提供了更貼近體內環境的平臺。
圖6. 3D neuMatrix的OGD/R建模與缺血性中風特征重現。
四、討論
利用3D生物打印技術構建了體外神經模型3D neuMatrix，該模型僅需7天即可形成具有多尺度功能連接的復雜可重現神經網絡。其鈣信號特征與大腦皮層功能架構相似，基因表達譜比2D培養更貼近E18皮層，且通過單細胞測序證實可重現大腦皮層細胞組成及發育動態，為神經環路機制、CNS疾病機制、藥物篩選及組織工程研究提供了有價值的體外平臺。
相比傳統2D培養和其他3D建模方法，3D neuMatrix在高通量構建、可重復性及神經網絡空間組織精度上優勢顯著。它優化了原代皮層細胞的生物打印流程，避免了iPSC衍生神經元成熟度不足的問題，能構建多種高保真CNS模型；其展現的多尺度功能性神經連接源于3D生物打印的預設空間cues，結合可擴展性有望用于神經組織修復與生物計算；在疾病建模方面，可高通量篩選藥物，結合基因編輯技術能模擬多種神經退行性疾病。
該模型也存在一定局限性，如生物墨水基于明膠無法完全重現大腦ECM，打印過程可能造成剪切力損傷，培養期間細胞簇增大可能引發缺氧反應，且缺乏血管化結構影響病理模擬完整性。未來需通過優化生物墨水、引入新興生物制造技術及構建血管化結構等方式提升模型的生理模擬真實性。
五、結論
綜上，利用3D生物打印技術構建了體外神經組織3D neuMatrix，其具有明確的細胞組成、神經環路及可調控的空間組織。單細胞分析顯示，體外培養期間神經元亞型和神經膠質細胞分化，神經通訊相關基因表達上調。通過3D neuMatrix進行的疾病建模證實，其有望為CNS疾病的發病機制和治療研究提供更貼近生理的模型。
六 、參考文獻
H. Yang, J. Zhang, Y. Li, Z. Zhong, W. Li, H. Luo, Y. Liu, L. Ouyang, Z.Jiang, Y. Sun, H. Sun, L. Liu, H. Yang, Y. Wang, N. Yang, W. Ma, Y. Mao,Multiscale Organization of Neural Networks in a 3D Bioprinted Matrix. Adv. Sci.2025, e04455.
(責任編輯：admin)
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